毛主席纪念堂的二层由毛泽东、周恩来、刘少奇、朱德、邓小平、陈云同志革命业绩纪念室及宣教厅、藏品陈列室组成。
二层各纪念室按照时间顺序和分专题的方式,以大量珍贵的照片、文献、文物完整展现了6位老一辈革命家的丰功伟绩和崇高风范。宣教厅用以开展主题宣讲,放映文献纪录片《千秋伟业》,生动展现中华民族从站起来、富起来到强起来的伟大飞跃,教育引导广大党员群众深刻领悟“两个确立”的决定性意义,不断增强“四个意识”、坚定“四个自信”、做到“两个维护”。藏品陈列室陈列着全国人民敬献的珍贵物品,表达了人民群众对党、对党中央、对党的领袖的深厚感情。